鈦種植體雖然因良好的“骨結合”［1］性能被廣泛應用［2－3］，但也會(huì )因金屬過(guò)敏或美學(xué)問(wèn)題而被限制應用［4］。隨著(zhù)數字化技術(shù)與修復技術(shù)緊密結合，氧化鋯種植修復有了技術(shù)突破［5－6］。本研究已建立氧化鋯種植體的三維模型［7］，并制造3D打印氧化鋯種植體和計算機輔助設計與制造(computer aided design ＆ computer assomated manufacture，CAD/CAM) 氧化鋯種植體。
為了氧化鋯種植體能夠達到與BEGO鈦種植體TiPurePlus 相當的表面粗糙度(粗糙度Ra= 1～2μm)［8－9］，預先對其表面進(jìn)行噴砂和加熱酸蝕處理。采用硬組織切片技術(shù)和反向轉矩實(shí)驗，比較兩組氧化鋯種植體與某公司純鈦種植體的成功率、骨結合率、種植體周骨密度和反向轉矩值，評價(jià)氧化鋯種植體骨結合性能［10］。
1.1 實(shí)驗材料
1.1.1 主要儀器Exakt510 脫水儀、Exakt520 光固化包埋機、Exakt 300CP 切片機、Exakt 400CS 磨片機(EXAKT公司，德國)，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本) 。
1.1.2 手術(shù)器械NSK種植機(NSK公司，日本)，種植器械盒(Thommen Medical AG，瑞士) ，手術(shù)刀柄，刀片，持針器骨膜剝離器，血管鉗，組織剪，1號絲線(xiàn)，巾鉗，鋪巾。
1.1.3 實(shí)驗藥物速眠新(圣達動(dòng)物藥品有限公司，中國)，3%戊巴比妥鈉(科豐化學(xué)試劑有限公司，中國) ，注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，中國) ，多聚甲醛溶液、亞甲基藍、酸性品紅、高錳酸鉀、苦味酸、磷酸氫二鈉(豪普斯生物技術(shù)有限公司，中國) 。
1.1.4 種植體根據實(shí)驗目的分為3組。
- 實(shí)驗組1: 經(jīng)過(guò)表面處理的3D打印氧化鋯種植體20枚(昆山博力邁三維打印科技有限公司) (圖1A) ;
- 實(shí)驗組2: 經(jīng)過(guò)表面處理的CAD/CAM 氧化鋯種植體20枚(杭州口腔醫院)(圖1B) ;
- 實(shí)驗組3: 某知名公司提供純鈦超親水種植體20枚(上海宇井貿易有限公司)。
所有種植體直徑3.5mm，長(cháng)度8mm，穿齦2mm，基臺高度4mm。
1.2 實(shí)驗方法
1.2.1 兩組氧化鋯種植體植入前表面處理3D打印氧化鋯種植體和CAD/CAM氧化鋯種植體植入前采用顆粒尺寸為250μm 的Al2O3粒子，噴砂力度0.8MPa，距離18mm，垂直噴砂4個(gè)循環(huán)，40%氫氟酸60℃酸蝕60min，蒸餾水超聲震蕩干燥后采用掃描電鏡對3D打印氧化鋯種植體和CAD/CAM氧化鋯種植體表面形貌進(jìn)行顯微觀(guān)察。
1.2.2 實(shí)驗動(dòng)物及模型制作實(shí)驗動(dòng)物成年雄性健康的Beagle犬共6只，15個(gè)月齡，質(zhì)量為16～17kg。實(shí)驗動(dòng)物使用許可證號: SYXK(浙)2018-0012。使用動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號: 201807863。動(dòng)物種植體植入手術(shù)及飼養均在浙江中醫藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中心進(jìn)行，所有實(shí)驗動(dòng)物在手術(shù)前均在籠子中隔離飼養1周。
將60枚植體編號1～60號，按隨機分配的原則(隨機數字表)植入6只Beagle犬的脛骨中，每只Beagle犬每側脛骨植入5枚種植體。全麻前準備:術(shù)前禁食12h；術(shù)前0.5h肌注青霉素鈉80萬(wàn)U以預防感染。種植手術(shù)：氣管插管下，速眠新(0.04～0.08mg/kg) 對Beagle犬進(jìn)行后腿肌肉注射。全麻起效后，常規消毒鋪巾，后腿阿替卡因1.7mL浸潤麻醉，切開(kāi)、翻瓣、暴露脛骨外側，逐級預備種植窩，植入種植體，安放愈合帽。對位縫合創(chuàng )口，種植術(shù)后即刻拍攝X線(xiàn)片，觀(guān)察植入位置、角度(圖2)。術(shù)后常規抗感染處理。
1.2.3 標本處理在8周時(shí)，取3組種植體各10枚進(jìn)行反向扭矩測試，將扭力扳手與種植體垂直相接，緩慢擰出種植體，扭力扳手刻度顯示將種植體擰松的扭力值即為旋出扭力峰值。隨后處死Beagle犬，將帶有種植體的脛骨整段鋸下(圖3)，生理鹽水反復沖洗，固定后制備不脫鈣硬組織切片。
1.2.4 不脫鈣種植體骨切片的制備和染色用4%的甲醛固定浸泡，4℃冰箱保存72h，然后用70%乙醇溶液浸泡。修整帶種植體的標本，標本大小約5mm×15mm×10mm，在Exakt510 脫水儀中使用70%～100%的乙醇溶液梯度脫水，在Exakt520光固化包埋機中進(jìn)行樹(shù)脂浸透包埋和聚合(圖4)。完成聚合反應后，準備A、B 兩張載玻片，用Technovit 4000粘接劑把標本包埋塊粘合于載玻片A上，將載玻片A吸附于切片機夾具上，修整組織塊，使用Exakt 400CS 磨片機對標本表面進(jìn)行拋光，然后用Technovit-7210VLC膠水將載玻片B粘合于標本的拋光面側，形成兩側載玻片、中間組織塊的雙夾結構。將載玻片A吸附在Exakt 300 CP a切片機夾具上，將切割厚度設定為150～200μm，切下載玻片B側約150μm厚的切片，使用SiC和Al2O3砂紙自動(dòng)磨片，設置厚度為30μm，再用細砂紙進(jìn)行切片表面拋光，最終制作出厚度約為30μm的光滑種植體骨磨片。將切磨好的骨切片使用雙蒸水進(jìn)行超聲清洗10min，自然干燥后用亞甲基藍－酸性品紅色，樹(shù)脂封片。
1.2.5 圖像分析/光學(xué)觀(guān)察及骨接觸率測定在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像，結合圖像處理軟件(Image-Pro Plus6.0)進(jìn)行測量并根據骨接觸率(bone-to-implant contact，BIC)和種植體周?chē)敲芏?bone density，BD)公式計算，得到兩組氧化鋯種植體和某知名公司純鈦組種植體的不含骨髓腔骨結合率、含骨髓腔骨結合率、平均骨接觸率和種植體周?chē)敲芏?。骨接觸率(不含骨髓腔)=骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)與種植體螺紋實(shí)際接觸的長(cháng)度之和/種植體螺紋植入骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)的長(cháng)度×100%；骨接觸率(含骨髓腔)=骨髓腔與種植體螺紋實(shí)際接觸的長(cháng)度之和/種植體螺紋植入骨髓腔內的長(cháng)度×100%；平均骨接觸率=骨與種植體實(shí)際接觸長(cháng)度之和/種植體螺紋植入骨組織內的長(cháng)度×100%；種植體周?chē)敲芏?BD)=骨結合區域/整個(gè)結合區域×100%［11］，測量方法為在螺紋端上放置一條切線(xiàn)，計算該切線(xiàn)與槽內種植體輪廓之間的像素。
1.3 統計學(xué)處理
采用SPSS17.0軟件包對所有實(shí)驗數據處理。進(jìn)行統計學(xué)處理后的數據以(X的平均值±s)表示。數據采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異有顯著(zhù)性。
2.1 兩組氧化鋯種植體表面處理后掃描電鏡觀(guān)察結果見(jiàn)圖5～6，可見(jiàn)經(jīng)噴砂+酸蝕后的氧化鋯表面形成均勻的粗化效果。3D打印組表面大孔徑12～17μm，小孔徑1.1～2.6μm。經(jīng)噴砂+酸蝕后的CAD/CAM組表面大孔徑18～21μm，小孔徑1.0～2.6μm。
2.2 影像學(xué)觀(guān)察結果
術(shù)后離體的Beagle犬脛骨經(jīng)便攜式X線(xiàn)機拍照，得到種植體植入的骨界面愈合情況(圖7) 。種植體和周?chē)墙M織嵌合緊密無(wú)間隙存在，螺紋均位于骨平面以下，光滑面均位于脛骨骨皮質(zhì)外，植體植入方向與骨面垂直，植體之間的間距在2～3 mm，植體周?chē)匆?jiàn)異常透射影像。三組種植體的成功率均為100%。
2.3 反向轉矩值統計
3D打印氧化鋯種植體組及CAD/CAM氧化鋯種植體組的反向轉矩值均大于35N·m；鈦種植體組中2顆為20～35N·m，8顆大于35N·m。
2.4 亞甲基藍－酸性品紅染色、骨接觸率測定(圖8)為種植體植入8周后，3D打印氧化鋯種植體、CAD/CAM氧化鋯種植體和純鈦種植體的亞甲基藍酸性品紅染色圖。亞甲基藍酸性品紅染色可清晰顯示新舊骨組織邊界和成骨細胞，便于區分軟硬組織。圖中可看到紫紅色的是骨小梁，藍色的是間質(zhì)。新生的編織骨較疏松，染色較深紫色；密質(zhì)骨為淺紫色，骨小梁間的纖維網(wǎng)狀結構為淺藍色，纖維軟組織呈深藍色，藍色為類(lèi)骨質(zhì)。另外，位于螺紋表面可以看到較粗的新生骨小梁。3組種植體不含骨髓腔骨結合率、含骨髓腔骨結合率、平均骨接觸率和種植體周?chē)敲芏葦抵等?表1)所示，差異均無(wú)顯著(zhù)性(P＞0.05)。
評價(jià)種植體骨結合性能的方法主要有影像學(xué)檢查、旋出扭力法、硬組織切片技術(shù)等。本研究選擇Beagle犬作為實(shí)驗動(dòng)物模型來(lái)評價(jià)種植體的骨結合性能，結合自身實(shí)驗條件，選擇X線(xiàn)牙片縱向觀(guān)察種植體骨界面愈合情況、種植體旋出扭矩、種植體骨接觸率、種植體周?chē)敲芏鹊戎笜藖?lái)比較3D打印氧化鋯種植體、CAD/CAM氧化鋯種植體、純鈦種植體的骨結合性能。
本實(shí)驗采用X線(xiàn)片方法，觀(guān)察種植體植入術(shù)后8周的骨界面愈合情況，結果顯示3組標本均未發(fā)現種植體周?chē)惓Ｍ干溆跋?，植體植入的三維位置與相互距離均正確，表明實(shí)驗動(dòng)物模型成功建立。
旋出扭力法屬破壞性實(shí)驗，會(huì )使種植體的骨結合產(chǎn)生不可逆的損傷，所以臨床應用受到限制。但其仍是動(dòng)物實(shí)驗中評價(jià)骨結合程度的重要方法，一般采用數字扭力測試儀測量并記錄種植體骨結合被破壞時(shí)的扭力峰值，間接評價(jià)骨結合的狀況。Sullivan 等［12］通過(guò)臨床研究，將20N?m 的扭力閾值作為種植體骨結合成功的標準。本實(shí)驗使用扭力扳手測量旋出扭矩峰值，結果顯示種植體植入術(shù)后8周以后，3組種植體扭力峰值均大于20N?m，提示各組種植體均能形成良好的骨結合，可認為是成功骨結合的標準［13］。
不脫鈣種植體骨切片技術(shù)因其可以保存骨組織的細微結構，已被廣泛用于種植體骨結合的形態(tài)學(xué)研究。主要的骨形態(tài)計量學(xué)參數有骨接觸率和種植體周?chē)敲芏?。骨接觸率和種植體周?chē)敲芏戎饕从撤N植體周?chē)鹿切纬傻牧?，這個(gè)量很難達到100%［14］。文獻報道氧化鋯種植體的BIC為27.1%～74.0%［15－16］，純鈦種植體的BIC為23.2%～83.7%［17－18］，一般認為大于50%為適宜的骨結合率［19］。并且所有研究均顯示，同一觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)氧化鋯種植體和鈦種植體BIC差異無(wú)統計學(xué)意義。本研究植入8周時(shí)的組織學(xué)結果顯示，3 組樣本的平均骨接觸率均達到48%以上，種植體周?chē)敲芏染?8%以上，均可獲得良好的初期穩定性，并且3組骨接觸率和種植體周?chē)敲芏鹊牟町悷o(wú)顯著(zhù)性?；诒狙芯康慕Y果可得出，3D打印氧化鋯種植體、CAD/CAM氧化鋯種植體和純鈦種植體可達到相似且良好的骨結合程度，此結果和Stenlund、王曉娜等的研究結果一致［20－21］。
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