針對傳統樹(shù)脂包埋法缺點(diǎn)的改良報道較少，有科研團隊嘗試構建識別程序以提高效率［17］。有文獻報道了一種預防軟組織樹(shù)脂切片發(fā)生脫片的方法［16］，也有通過(guò)改善載玻片的方式進(jìn)行預防脫片的報道［18］。但國內對不脫鈣樹(shù)脂包埋切片的報道仍以介紹性的報道為主［19-20］。目前國內外尚沒(méi)有在樹(shù)脂液凝固、切片、染色過(guò)程中對樹(shù)脂包埋不脫鈣骨技術(shù)的改良方法的報道。為提高不脫鈣骨組織的樹(shù)脂包埋法的效率及穩定性，我們對大量實(shí)驗經(jīng)驗進(jìn)行了總結，嘗試對傳統的樹(shù)脂包埋切片法進(jìn)行改良。結果發(fā)現，將復數脛骨樣本平行包埋于一個(gè)樹(shù)脂塊中有效可行，提高了樹(shù)脂塊的利用率。利用CO2沖入樹(shù)脂包埋液，可有效縮短樹(shù)脂凝固時(shí)間并提高樹(shù)脂凝固率。在切片過(guò)程中，使用未凝固樹(shù)脂制備液涂抹切面可顯著(zhù)減少小塊硬質(zhì)骨組織脫片的發(fā)生，且不會(huì )影響對骨形成的分析。在染色分析前，發(fā)現加熱切片樣本可以降低脫片率，且不影響成骨細胞的分析。改良樹(shù)脂包埋多個(gè)小鼠不脫鈣骨組織的方法為樹(shù)脂包埋不脫鈣骨組織研究提供了有效的、高效的方法思路，可能是一種理想的骨組織學(xué)研究方法。具體報道如下。

1.1 實(shí)驗動(dòng)物
13周齡雄性C57BL/6J 小鼠15 只（Jackson Laboratory），體質(zhì)量27.3±0.76 g。動(dòng)物實(shí)驗經(jīng)美國特種外科醫院實(shí)驗動(dòng)物使用與管理委員會(huì )以及美國康奈爾大學(xué)醫學(xué)部IACUC批準。
1.2 主要試劑
鈣黃綠素、壬基苯基-聚乙二醇乙酸酯（NPG）、過(guò)氧化苯甲酰（BPO）、丁二醇、甲苯胺藍O、固綠FCF、無(wú)水切片封固劑及1-乙酰氧基- 2-甲氧基乙烷（AME）（Sigma）。單體甲基丙烯酸甲酯（MMA）、N，N-二甲基-對甲苯胺（DMPT）（WAKO）。氧化鋁60、水性切片封固劑（Millipore），尿素（Fisher Scientific）。
1.3 小鼠骨組織熒光標記及骨組織準備
小鼠在12.3周齡時(shí)腹腔注射鈣黃綠素（2.5 mg/mL），按每克小鼠體質(zhì)量注射10 μL，3 d后同劑量注射第2次鈣黃綠素，再過(guò)2 d后以CO2窒息法處死小鼠［21］，取小鼠小腿置于10%福安馬林液中固定2 d。隨后用鑷子及組織剪清除附著(zhù)于脛骨的肌肉、肌腱等軟組織，去除腓骨。將脛骨置于搖床上常溫乙醇梯度脫水（70%乙醇1 d→80%乙醇1 d→90%乙醇1 d→100%乙醇2 d），脫水完畢后立即進(jìn)行樹(shù)脂液（表1）滲透3 d（第2天更換樹(shù)脂滲透液1次）。乙醇及滲透液液面應高于包埋盒2 cm。
1.4 樹(shù)脂包埋液的配制以及凝固時(shí)間測試
將樹(shù)脂包埋液按照制備方法的不同分為沖入CO2（實(shí)驗組）、沖入空氣（對照組）兩組。實(shí)驗組：按照NPG7 mL，MMA工作液100 mL，BPO 550 mg比例加入錐形瓶并攪拌，攪拌過(guò)程中沖入CO2 15 min（圖1A）。然后加入DMPT 500 μL，繼續攪拌10 min后進(jìn)行分裝。對照組：按照NPG 7 mL，MMA工作液100 mL，BPO 550 mg比例加入錐形瓶并攪拌，攪拌過(guò)程中以電子移液槍輔助沖入空氣15 min。然后加入DMPT 500 μL，繼續攪拌10 min后進(jìn)行分裝。分別將兩組包埋液分裝入液體閃爍瓶（20 mL圓柱形玻璃瓶，用于組織包埋，下文中統稱(chēng)為組織包埋瓶）中，10 mL/瓶，每組10瓶，記錄并比較兩組包埋液的凝固時(shí)間及凝固程度。
1.5 復數脛骨的包埋
按照上述沖入CO2組的配制方式制備包埋液。取內徑4 mm的火石玻璃管，用乙醇燈燒結封閉玻璃管一端，管內加入包埋液，然后依次將滲透完畢的脛骨置于玻璃管中，兩脛骨間隔約4 mm。將玻璃管豎立，開(kāi)口向上，用包埋液填滿(mǎn)玻璃管后以鋁箔封口，最上端脛骨距離管口應大于3 cm，4 ℃下凝固4 h。包埋液凝固后，敲碎玻璃管，取出包埋有脛骨的樹(shù)脂管，用精密金剛石刀輪機（VC50，LECO 公司）在脛骨近端1/4 處切斷樹(shù)脂塊。取余長(cháng)為3/4的脛骨進(jìn)行第2次包埋。預先用刀輪機制備2 mm×10 mm×10 mm的硬質(zhì)樹(shù)脂片作為底板，為復數脛骨切面提供光滑貼合平面。脛骨切面蘸取包埋液，然后豎立貼合在底板上，每塊底板放置5根脛骨，共制作6個(gè)樹(shù)脂塊用于后續實(shí)驗。隨后將貼合有脛骨的底板平放于組織包埋瓶中，每瓶加入10 mL包埋液，4 ℃下凝固4 h。
1.6 切片及比較切片前涂抹包埋液對脫片的影響
敲碎組織包埋瓶，將樹(shù)脂塊修成合適形狀后，選用Leica TC65 硬質(zhì)標本專(zhuān)用刀片，在全自動(dòng)旋轉切片機（RM2255，Leica）上進(jìn)行切片。調節樹(shù)脂塊位置與角度，使得刀片切面與復數脛骨切面相平行，切片速度設置為1.5，切片厚度為4 μm。切片時(shí)按照是否涂抹包埋液分成涂抹包埋液組與不涂抹包埋液組。涂抹包埋液組：每次切片前在組織塊切面滴1滴包埋液，用紗布在切面抹勻，大約10 s 包埋液即會(huì )干燥，隨后進(jìn)行切片。不涂抹包埋液組：不涂抹包埋液直接進(jìn)行切片。兩組分別于同一樹(shù)脂塊收集8張切片，使用6個(gè)樹(shù)脂塊進(jìn)行重復實(shí)驗，記錄并比較兩組脛骨的脫片情況。對于缺損的脛骨切片，剩余面積大于1/2記為有效的切片，小于1/2記為無(wú)效的切片。切片后用展片液（表1）輔助展片，以薄塑料片蓋片后用鉆床虎鉗對切片進(jìn)行加壓，烘箱中55 ℃干燥2 d。

1.7 鈣黃綠素熒光分析與比較
切片烘干后，置于熒光顯微鏡下觀(guān)察鈣黃綠素熒光顯像情況。利用Osteomeasure 軟件分析新骨形成情況。比較涂抹包埋液對骨形成分析的影響。
1.8 探索加熱對切片脫塑水化時(shí)脫片的影響及成骨細胞染色觀(guān)察分析
樹(shù)脂切片染色前需要進(jìn)行脫塑及水化處理。選用來(lái)自上述涂抹包埋液組的切片，在脫塑前，按照是否加熱隨機分成兩組，每組24 張切片，其中加熱組為實(shí)驗組，不加熱組為對照組。加熱組：將切片置于干浴孵化器上95 ℃加熱15 min，隨后進(jìn)行脫塑（AME 15 min→AME 15 min）及水化（100%乙醇5 min→100%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→超純水5 min→超純水5 min）。不加熱組：室溫放置切片15 min。隨后進(jìn)行脫塑及水化。水化完成后，統計分析兩組脫片情況。隨后對切片進(jìn)行甲苯胺藍染色。觀(guān)察并分析成骨細胞數量及成骨細胞表面參數，比較加熱對染色情況的影響。
1.9 分析軟件及統計方法
本實(shí)驗中骨生成定量分析及成骨細胞定量分析使用Osteomeasure7.1 軟件。切片觀(guān)察使用熒光顯微鏡（BX53F，Olympus），拍攝使用DP73 顯微數碼相機（Olympus）及CellSens1.9軟件。本實(shí)驗數據統計分析使用IBMSPSS20.0軟件，結果中數據用均數±標準差表示，數據統計使用Student-t分析檢驗方法進(jìn)行比較，P<0.05認為差異有統計學(xué)意義。
2.1 向包埋液沖入CO2可以縮短包埋液的凝固時(shí)間
本實(shí)驗室用CO2沖入包埋液中（圖1A），以去除氧氣的影響。通過(guò)比較沖入CO2及沖入空氣兩組包埋液，結果發(fā)現，在0 h，CO2組的包埋液呈現淺黃色，空氣組的包埋液呈現較深的黃色。在1 h時(shí)，CO2組的包埋液呈粘稠液體狀，空氣組的包埋液呈稀釋液體狀。在4 h， CO2組的包埋液已完全凝固成樹(shù)脂塊，質(zhì)地堅硬，色澤透明淡黃；空氣組部分瓶中的包埋液呈粘稠液體狀，部分瓶中包埋液呈稀釋液體狀，稀釋液體顏色深于已凝固樹(shù)脂（圖1B）。在72 h，空氣組的包埋液完全凝固瓶數為7瓶，其余3瓶均只有底層包埋液凝固，上層包埋液呈現粘稠液體狀。結果顯示向包埋液中沖入CO2可以縮短樹(shù)脂凝固時(shí)間（圖1C），同時(shí)可以提高樹(shù)脂的凝固成功率（圖1D）。

圖1 向包埋液沖入二氧化碳可以縮短包埋液的凝固時(shí)間
Fig.1 Flowing CO2 into the embedding solution reduces polymerization time. A: Schematic diagram of flowing CO2 into theembedding solution; B: Represent pictures showing polymerization of the blocks in CO2 and air groups at 0, 1, 4, and 8 h. The pictures were taken immediately after tilting the vial to observe the viscosity and polymerization of the solution; C: Number of complete polymerized blocks of CO2 and Air groups over time(n=10); D: Rate of complete polymerized blocks of CO2 and Air groups (n=10).

2.2 使用兩次包埋的方式可以將多個(gè)脛骨包埋于一個(gè)樹(shù)脂塊中
第1次包埋時(shí)將脛骨包埋成圓柱樹(shù)脂塊（圖2A），隨后將所有脛骨在相同的相對位置切斷（距脛骨平臺1/ 4處切斷脛骨，圖2B）。二次包埋時(shí)，沾有包埋液的脛骨切面可以與底板貼合緊密，不易傾倒（圖2C、D）。

圖2 使用兩次包埋的方式可將多個(gè)脛骨包埋于同一樹(shù)脂塊中
Fig.2 Multiple tibias embedded in the same block by 2-step embedding. A: Embedding multiple tibias in a flint glass tube; B: Trimmingthe tibia at the 1/4 proximal part; C: Embedding multiple tibias while maintaining the section plane flat; D: Polymerized block withmultiple tibias.

2.3 使用包埋液涂抹切面可以降低切片時(shí)脫片率而不影響鈣黃綠素熒光分析
本實(shí)驗發(fā)現，樹(shù)脂包埋骨組織切片時(shí)，若骨組織切面較小，則容易發(fā)生脫片（如顱骨的矢狀面切片，長(cháng)骨的橫截面切片），若骨組織相對較大或周?chē)浗M織較多，則較少發(fā)生脫片（如腰椎的冠狀面切片，股骨的冠狀面切片）。小鼠脛骨的橫截面小，其近中段位置主要為骨髓以及密質(zhì)骨。密質(zhì)骨本身質(zhì)脆堅硬，當對脛骨橫截面進(jìn)行切片時(shí)，脛骨周?chē)臉?shù)脂難以固定切面脛骨而被一同切下，在切片過(guò)程中會(huì )出現嚴重的脫片現象（圖3A）。通過(guò)計數發(fā)現，切片時(shí)涂抹包埋液組有效切片數為35.5±2.35，脫片率為（11.25±0.0）%；不涂抹包埋液組的有效切片數為13±4.65，脫片率為（67.5±0.12），涂抹包埋液可以顯著(zhù)減少切片時(shí)的脫片的發(fā)生（圖3D）。涂抹包埋液后，切片更加完整（圖3B），不會(huì )影響對鈣黃綠素熒光的觀(guān)察（圖 3C），涂抹組及不涂抹組的 MAR 及BFR/BS 分析差異無(wú)統計學(xué)意義（P>0.05）。涂抹包埋液在切面上，因包埋液干燥后可以形成一層樹(shù)脂膜，這相當于在切面上將所有組織覆蓋。當刀片經(jīng)過(guò)切面時(shí)，覆蓋于其上的樹(shù)脂膜對切面脛骨起到固定作用，使脛骨與周?chē)鷺?shù)脂一同被切下。

圖3 使用包埋液涂抹切面可預防切片時(shí)脛骨脫片
Fig.3 Application of embedding solution on the section surface prevents slide detachment without affecting calcein labeling analysis.
A: Representative scan pictures of Paste and Un-paste slides(scale bar=1 mm); B: Representative unstained paste and non-paste slides under microscope (left panel: scale bar=200 μm; right panel: scale bar=100 μm); C: Representative fluorescent pictures of paste and non-paste slides (left panel: scale bar=100 μm; right panel: scale bar=50 μm); D: Number of effective slides and rate of slides detachment in paste and non-paste groups (***P<0.001, n=6); E: Mineral apposition rate (MAR, μm/d) and bone formation rate (BFR/BS, %/d) in paste and non-paste groups (n.s: P>0.05, n=12).

2.4 脫塑前加熱切片可以降低水化后脫片率并且不影響甲苯胺藍染色結果
將實(shí)驗條件設置為95 ℃加熱15 min，通過(guò)計數發(fā)現，加熱組在脫塑水化后每張切片剩余有效脛骨切面數3.17±1.31，脫片率為（28.97±0.29）%。不加熱組在脫塑水化后每張切片剩余有效脛骨切面數1.92±0.97，脫片率為（56.60±0.22）%。脫塑前加熱切片可顯著(zhù)性減少脫塑及水化操作造成的脫片（P<0.001，圖4B）。隨后對切片進(jìn)行了甲苯胺藍染色觀(guān)察成骨細胞的情況，結果顯示，加熱并不會(huì )影響對甲苯胺藍染色的染色。加熱組和不加熱組的成骨細胞分析N.Ob/B.Pm和Ob.S/B.S結果差異無(wú)統計學(xué)意義（P>0.05，圖4C）。

圖4 脫塑前加熱切片可降低水化后脫片率而不影響甲苯胺藍染色結果
Fig.4 Heating before deplastic and hydration prevents slide detachment during staining without affecting Toluidine blue staining.A: Represent Toluidine blue stain of Heated and Un-heated group (A1,A4 scale bar=200 μm,A2,A5 scale bar=100 μm,A3,A6 scale bar=50 μm); B: Number of attached bones per slide of Heated and Un-heated group after hydration(**P<0.01, n=24); C: Number of osteoblast per bone surface and osteoblast surface per bone surface of Heated and Un-heated group (P>0.05, n=12).


鈣黃綠素可以標記骨表面，如果在相同時(shí)間間隔進(jìn)行兩次鈣黃綠素注射，則可以通過(guò)分析兩次標記的范圍及距離，比較這段時(shí)間間隔內新生骨形成的情況，是成骨細胞功能研究中的常用方法［24-25］。由于脫鈣后將無(wú)法觀(guān)測到鈣黃綠素的標記，因此石蠟包埋法并不適用于觀(guān)察新生骨形成的變化。不需要脫鈣的樹(shù)脂包埋切片法則能夠發(fā)揮重要作用，并逐漸在國內得到推廣。此外，國內外也有關(guān)于不脫鈣骨組織的冰凍切片法的報道［23, 26-27］，但因需要頻繁更換刀片，包埋試劑及切片貼紙價(jià)格昂貴，標本需要低溫保存等缺點(diǎn)而暫時(shí)未能廣泛推廣。樹(shù)脂包埋切片耗費的時(shí)間較長(cháng)，如果可以在構建標本塊時(shí)將多個(gè)骨樣本按照相同位置包埋固定，切片時(shí)的效率就能明顯提高。本實(shí)驗室首次探索了復數脛骨平行包埋的方案，包埋時(shí)可以確保所有脛骨切面在同一平面上，切片時(shí)位置角度調整方便高效。與傳統的包埋方式相比，此方案不僅明顯縮短了實(shí)驗的耗時(shí)，還減少了包埋液的使用量，更加節約開(kāi)支。
傳統的樹(shù)脂包埋方式另一缺點(diǎn)是樹(shù)脂塊需要3~6 d時(shí)間才能完全凝固［19］，偶爾還會(huì )出現無(wú)法凝固成硬質(zhì)樹(shù)脂塊的情況，若在這種情況下嘗試包埋多個(gè)脛骨，難以保證實(shí)驗的成功率。既往有文獻提出，氧氣會(huì )影響樹(shù)脂塊的凝固［22］。我們首次嘗試在制備包埋液的過(guò)程中沖入CO2，在不影響各試劑配比的情況下，明顯縮短了樹(shù)脂塊的凝固時(shí)間，并且提高了樹(shù)脂塊的凝固成功率。關(guān)于沖入CO2可以縮短樹(shù)脂凝固時(shí)間的原因則尚未明確，猜測環(huán)境中O2可能可以影響樹(shù)脂分子交聯(lián)，CO2沖入可以移除包埋液環(huán)境中O2，從而對樹(shù)脂分子的交聯(lián)產(chǎn)生保護作用，氮氣可能也可以發(fā)揮相似作用，但實(shí)驗室中CO2相對容易獲得，因而采用CO2進(jìn)行實(shí)驗。
按照本研究包埋方式，第1次包埋時(shí)將脛骨包埋成圓柱樹(shù)脂塊，隨后將所有脛骨在相同的相對位置切斷（距脛骨平臺1/4處切斷脛骨）；二次包埋時(shí)，沾有包埋液的脛骨切面可以與底板貼合緊密，不易傾倒。這可以確保在切片時(shí)，每個(gè)脛骨切面的相對位置幾乎一致，不會(huì )因為解剖位置差異過(guò)大而導致誤差。此前，本實(shí)驗室曾嘗試直接切斷脛骨后多個(gè)脛骨平行豎立包埋，但由于橫截面小，脛骨難以豎立在底板上，操作耗時(shí)長(cháng)。直接豎立在底板上的脛骨容易傾倒，切片時(shí)無(wú)法同時(shí)切出相對位置一致的切面，對實(shí)驗分析造成較大影響。改良后，我們發(fā)現采用兩次包埋的方式可以將多個(gè)脛骨包埋于一個(gè)樹(shù)脂塊中，為隨后的切片提高了效率。13周齡的小鼠脛骨中段橫截面直徑大約為1.5mm，如此小的密質(zhì)骨橫截面在切片過(guò)程中難以隨同樹(shù)脂一并切下，因而會(huì )發(fā)生嚴重的切片脫片現象。因此，我們提出了使用包埋液涂抹的方式輔助切片，并發(fā)現其可以顯著(zhù)地降低切片過(guò)程中的脫片率。這一方法也可用于預防顱骨矢狀面樹(shù)脂切片脫片。因涂抹的包埋液與樹(shù)脂成分一致，這種方法并不會(huì )影響切片在后續操作中的展片、脫塑以及鈣黃綠素熒光分析，是一種優(yōu)良的切片輔助方式。此外，不脫鈣骨組織樹(shù)脂切片在染色時(shí)容易發(fā)生脫片。有相關(guān)文獻報道了不同的防脫片液對預防脫片的效果［18］，但制作脫片液耗時(shí)較長(cháng)。有研究通過(guò)厚度為10~20 μm的軟組織樹(shù)脂切片進(jìn)行實(shí)驗，驗證了在115~140 ℃加熱30 min后可以預防脫片［16］。本實(shí)驗室首次嘗試使用加熱的方法預防不脫鈣骨薄切片脫片，發(fā)現95 ℃加熱15 min可以有效降低脫塑水化后的脫片率，并且不會(huì )影響甲苯胺藍染色的觀(guān)察以及成骨細胞的分析。小鼠是骨科基礎研究中的重要模型［5, 28］，而盡量保留骨骼成分對骨組織學(xué)研究有重要意義。本研究對傳統的樹(shù)脂包埋不脫鈣骨組織方法進(jìn)行了探索與改良，提出同時(shí)包埋復數小鼠不脫鈣脛骨的方法，提高了獲得及分析新生骨形成及骨礦化數據的效率，這一方法可能是一種理想的不脫鈣骨組織研究方法。但在樹(shù)脂包埋不脫鈣骨組織實(shí)驗中，依然存在一部分待解決的問(wèn)題，比如切片在的展片過(guò)程中容易發(fā)生變形，切片干燥后難以與覆蓋其上的塑料片分離等。本研究將在未來(lái)的實(shí)驗中對這些問(wèn)題進(jìn)行進(jìn)一步的探索，繼續優(yōu)化利用樹(shù)脂包埋不脫鈣骨組織的方案。

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